. Restrictie-enzymen zijn enzymen die zowel enkel- als dubbelstrengig DNA knippen. Elk restrictie-enzym heeft een specifieke nucleotidesequentie, een restrictieplaats genaamd, die het herkent en snijdt. Restrictie-enzymen worden gebruikt voor DNA-sequencing, mutatieanalyse en klonering en amplificatie van DNA. Wetenschappers gebruiken restrictie-enzymen om interessante genen in expressievectoren in te voegen, DNA-moleculen die afzonderlijk van chromosomaal DNA kunnen repliceren. De vector die het gen van belang bevat, kan vervolgens in een bacteriestam worden geïntroduceerd voor expressie en karakterisering van eiwitten.
Video van de dag
Stap 1
Identificeer restrictie-enzymsites op uw vector door naar een restrictiekaart te kijken. De restrictiekaart geeft aan welke enzymen je vector knippen en waar.
Stap 2
Kies een restrictie-enzym dat ook een site bevat die aanwezig is op uw gen-REPLACE, door naar de volgorde van de REPLACE te kijken. Zorg ervoor dat de restrictieplaats zich op een positie op uw REPLACE bevindt die buiten het gen van belang ligt, zodat u geen enkel deel van het gen verliest.
Stap 3
Zorg ervoor dat er nergens duplicaten van de restrictieplaats zijn in uw gen-REPLACE of vector. Dit zal meerdere snijwonden in je DNA veroorzaken en je misleidende gegevens opleveren.
Stap 4
Probeer restrictie-enzymen te kiezen die snijden met plakkerige uiteinden, in plaats van stompe uiteinden. Kleverige uiteinden treden op wanneer het enzym dubbelstrengs DNA op een verspringende manier snijdt, waardoor een enkelstrengige overhang overblijft die de bevestiging met een inzetstuk op de tegenovergestelde manier vergemakkelijkt. Blunt eindigt wanneer het dubbelstrengige DNA op een vlotte manier wordt gesneden en deze zijn moeilijker te bevestigen.
Stap 5
Kies een ander restrictie-enzym voor beide uiteinden van uw REPLACE om ervoor te zorgen dat het in de juiste richting in de vector wordt geplaatst en om ervoor te zorgen dat de vector niet opnieuw aan zichzelf hecht.
Stap 6
Probeer twee restrictie-enzymen te kiezen die goed functioneren in hetzelfde buffersysteem en dezelfde temperatuur. Als dit niet mogelijk is, voert u elke digestie afzonderlijk uit.
Dingen die u nodig hebt
- Sequentie van genREPLACEie
- Restrictiekaart voor vector naar keuze
- Lijst met restrictie-enzymen en hun knipplaatsen
Tips
- Sommige webprogramma's zijn ontwikkeld om te identificeren restrictieplaatsen op een DNA-sequentie snel. Een dergelijk programma is van New England BioLabs.
